利用基于液滴的微流體技術(shù)進(jìn)行DNA測序

    液滴生成技術(shù)使研究人員能夠使用最小樣本量進(jìn)行大規(guī)模研究，這種方法可以使 DNA 測序更加高效和經(jīng)濟(jì)。此外，它還可以幫助識別與癌癥診斷相關(guān)的單細(xì)胞內(nèi)微小變異。本文討論了液滴生成在 DNA 分析中的應(yīng)用，并展示了使用液滴微流體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所需的基本設(shè)置。

1 DNA分析的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

    科學(xué)家對DNA進(jìn)行分析，以識別癌癥突變、表征人類抗體及區(qū)分微生物等。DNA分析涉及多種技術(shù)，包括使用已知序列探針陣列或采用下一代測序（NGS）平臺對基因組進(jìn)行測序[1]。

    NGS平臺利用芯片陣列實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行分析，可同時(shí)檢測數(shù)億個分子，從而降低成本并提高效率[1]。

    然而，傳統(tǒng)芯片陣列的分析能力受限，且需要額外的流體處理和試劑混合系統(tǒng)，增加了實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜度并限制了總吞吐量。為了降低每個堿基的測序成本，通常需要并行處理多個樣本，而條形碼標(biāo)記雖然可以部分緩解此問題，卻增加了實(shí)驗(yàn)流程的時(shí)間[1]。

2 基于液滴的微流體技術(shù)

    微流控液滴技術(shù)是利用不可混溶的相（通常是水相和油相）生成離散液滴，并通過微流控泵高速精確控制液滴的生成[3]。其主要優(yōu)勢包括：

•  低樣本體積需求

•  高自動化程度

•  高通量

•  低成本

·    微流控設(shè)備能夠快速、精準(zhǔn)地控制流體體積，提高DNA分析吞吐量。例如，液滴微流控技術(shù)可實(shí)現(xiàn)每秒成千上萬個液滴的生成和分選[1]。

每個液滴即為獨(dú)立的反應(yīng)室，適用于數(shù)字PCR分子計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選和基因表達(dá)分析等應(yīng)用。反應(yīng)次數(shù)可隨著液滴生成速率的增加而擴(kuò)大，同時(shí)液滴體積的減小可降低試劑消耗，使實(shí)驗(yàn)更具靈活性[1]。

    整體而言，該技術(shù)可在極少的試劑消耗下進(jìn)行數(shù)億次反應(yīng)，極大提升實(shí)驗(yàn)效率并降低成本。然而與基于芯片陣列的固定點(diǎn)檢測不同，液滴在微流控通道中流動，無法通過位置信息標(biāo)記反應(yīng)結(jié)果，因此需要額外的標(biāo)記方法[1]。

3 高通量單細(xì)胞基因組測序

    傳統(tǒng)測序技術(shù)通常難以檢測基因組中的微小變異，因此科學(xué)家利用單細(xì)胞全基因組測序來識別拷貝數(shù)變異和單核苷酸變異[2]。

    通過微流控技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高通量、可擴(kuò)展的單細(xì)胞測序。例如，一項(xiàng)研究采用條形碼標(biāo)記技術(shù)，對單個癌細(xì)胞的擴(kuò)增基因組DNA進(jìn)行分析。該方法能夠在癌癥緩解期檢測到具有致病突變的細(xì)胞，并揭示急性髓系白血?。ˋML）腫瘤的復(fù)雜克隆進(jìn)化過程，這些信息是傳統(tǒng)測序方法無法捕獲的[3]。因此，該技術(shù)有望提高癌癥基因組異質(zhì)性分析的精度，并優(yōu)化個性化治療策略[3]。

4 如何開始實(shí)驗(yàn)？

    液滴微流控技術(shù)提供了一種高通量、低成本的DNA分析方式。如果您希望開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以下是所需的基本設(shè)備：

2-3臺微流控泵（或1臺具備2-3個通道的泵，如4U泵）——控制連續(xù)相（油相）和分散相（水相）的流動。推薦使用4U壓力泵或2-3臺ExiGo微流控注射泵，其中4U壓力泵可獨(dú)立控制4個通道，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且精準(zhǔn)的流量控制。

• 2-3個流量傳感器——實(shí)時(shí)監(jiān)測油相和水相的流量，確保流體穩(wěn)定。

• 微流控芯片——生成液滴并保證液滴尺寸的可控性。

• 穩(wěn)定的通道表面化學(xué)修飾——提高液滴穩(wěn)定性。

• 表面活性劑——穩(wěn)定油水界面，增強(qiáng)液滴的穩(wěn)定性。

• 油相——提高液滴穩(wěn)定性。

• 管路——連接泵與微流控芯片。

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參考文獻(xiàn)

1.  Abate, Adam R et al. “DNA sequence analysis with droplet-based microfluidics." Lab on a chip vol. 13,24 (2013): 4864-9. doi:10.1039/c3lc50905b

2.  Pellegrino, Maurizio et al. “High-throughput single-cell DNA sequencing of acute myeloid leukemia tumors with droplet microfluidics." Genome research vol. 28,9 (2018): 1345-1352. doi:10.1101/gr.232272.117

3.  Sohrabi, S., & Moraveji, M. K. (2020). Droplet microfluidics: Fundamentals and its advanced applications. RSC Advances, 10(46), 27560-27574.